產(chǎn)品簡(jiǎn)介

rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit 是一款能夠高效完成免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)的試劑盒。其包含高性能 rProtein A/G MagPoly Beads，能夠?qū)崿F(xiàn)快速便捷的磁性分離。另外試劑盒內(nèi)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的緩沖液，為免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提供了良好的反應(yīng)條件，增強(qiáng)了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。聚合物磁珠的配體是重組蛋白 A/G（約 14 kDa），同時(shí)擁有蛋白 A

和蛋白 G 的 IgG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有更廣的抗體亞型結(jié)合范圍。試劑盒的洗脫方式多樣，既可以用低 pH 的洗脫液將免疫復(fù)合物從蛋白 A/G磁珠上洗脫，也可以使用電泳上樣緩沖液以變性條件洗脫免疫復(fù)合物，直接進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)分析。

本產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞裂解物、細(xì)胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫沉淀反應(yīng)。

產(chǎn)品組成

保存及運(yùn)輸：2-8℃保存一年有效。

使用方法
1.緩沖液的準(zhǔn)備

可使用試劑盒準(zhǔn)備的緩沖液，也可根據(jù)實(shí)際情況配制不同的緩沖液體系。Lysis/Wash Buffer(5×) 在使用前請(qǐng)稀釋至并標(biāo)記為

1×Lysis/Wash Buffer，另根據(jù)需求，補(bǔ)加終濃度為0.1%-1% 的 Lysis/Wash Buffer Enhanced，標(biāo)記為 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。所有緩沖液在使用前建議用 0.22 μm或者 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，稀釋后的緩沖液建議4℃保存，若試劑渾濁，請(qǐng)立即丟棄。

下列可能用到的試劑及材料未提供，需額外準(zhǔn)備：

1) 電泳上樣緩沖液，非還原性（5×）：0.3 M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，50% 甘油，0.5% 溴酚藍(lán)

2) 二硫蘇糖醇（DTT）

3) 蛋白酶抑制劑

4) 免疫沉淀所用抗原、抗體

2. 樣品準(zhǔn)備

方案

I: 貼壁細(xì)胞的裂解

1) 小心去除單層細(xì)胞的培養(yǎng)基。

2) 用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞兩次。

3) 根據(jù)表2的推薦體積向細(xì)胞中加入預(yù)冷的 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。

4) 將上述裂解好的樣品轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中，約13000×g 離心 10 min，分離細(xì)胞碎片。

5) 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記為細(xì)胞裂解樣品。

方案 II：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的裂解

1) 將細(xì)胞懸液以1000×g離心 5 min，收集細(xì)胞，棄上清。

2) 用預(yù)冷PBS將細(xì)胞團(tuán)輕輕重懸，將細(xì)胞懸液以 1000×g 離心 5 min，收集細(xì)胞，棄上清。

3) 向細(xì)胞團(tuán)塊中加入預(yù)冷1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。每50 mg細(xì)胞團(tuán)塊使用 500 μL。

4) 將上述裂解好的樣品在冰上孵育5 min，期間混勻幾次。13000×g離心

10 min，去除細(xì)胞碎片。

5) 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，備蛋白濃度測(cè)定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記為細(xì)胞裂解樣品。

2.3 免疫沉淀

抗原、抗體與磁珠的結(jié)合順序可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，不同的孵育順序?qū)ψ罱K純度及抗原產(chǎn)量均有影響，以下方案為推薦常用的實(shí)驗(yàn)方法。

2.3.1 磁珠漂洗

1) 將 rProtein A/G MagPoly Beads 充分混勻，取 20 µL（0.2 mg）加入 1.5 mL 離心管中。

2) 向磁珠中加入 180 µL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，輕微渦旋混勻。

3) 將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

4) 向離心管中加入 1 mL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

2.3.2 免疫沉淀

方案一

1) 向上述準(zhǔn)備好的磁珠（步驟 2.3.1）中加入抗體，抗體推薦用量2-10 µg，用抗體保存液或 1×Lysis/Wash Buffer 補(bǔ)充體積至 500 µL，室溫混旋孵育30 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留樣用于檢測(cè)。

注：孵育溫度和時(shí)間范圍推薦為：室溫、30 min-2 h，或者 4℃、1 h-16 h，根據(jù)實(shí)際的結(jié)合效果進(jìn)行調(diào)整。

2) 向離心管中加入 500 µL 1×Lysis/Wash Buffer，顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻1 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清，重復(fù)至少兩次。

3) 向離心管中加入 500 µL 細(xì)胞裂解樣品（步驟2.2），每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)推薦的總蛋白量為500-1000 μg，體積不足 500 uL 可用

1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 補(bǔ)足，室溫混旋孵育 30 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留樣用于檢測(cè)。

注：孵育溫度和時(shí)間范圍推薦為：室溫、30 min-2 h，或者4℃、1 h-16 h，根據(jù)實(shí)際的結(jié)合效果進(jìn)行調(diào)整。

方案二

1) 在離心管中，將細(xì)胞裂解樣品（步驟 2.2）與抗體混合孵育 30 min。推薦抗體用量為2-10 μg，每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)推薦的細(xì)胞裂解液總蛋白量 為 500-1000 μg，體積不足建議用 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 將樣品體積調(diào)整至 500 μL。

2) 將孵育后的樣品加入準(zhǔn)備好的磁珠（步驟

2.3.1）中混旋孵育。 注：孵育溫度和時(shí)間范圍推薦為：室溫、30 min-2 h，或者4℃、1 h-16 h，根據(jù)實(shí)際的結(jié)合效果進(jìn)行調(diào)整。

3) 將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留樣用于檢測(cè)。

2.3.3 磁珠漂洗

1) 向離心管中加入 500 µL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清，重復(fù)一次。

2) 向離心管中加入 500 µL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，連同磁珠轉(zhuǎn)移至一個(gè)新 EP 管中，顛倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

2.3.4 洗脫

方案一 低pH 洗脫向離心管中加入 50 µL IP Elution Buffer，室溫混旋孵育 10 min，將離心管置于磁分離器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清為洗脫液，加入5 -10 μL Neutralization Buffer。

方案二 向離心管中加入 備選洗脫方法（變性洗脫） 50 µL(1×) 電泳上樣緩沖液，將樣品置于金屬浴中，96-100℃加熱 10 min。通過(guò)磁分離器分離磁珠，保留含有目的抗原的上樣緩沖液。

注：兩種洗脫方案均包含捕獲抗體及目的抗原，低 pH 洗脫樣本中抗體為完整結(jié)構(gòu)，變性洗脫樣本中抗體解離為重鏈、輕鏈，請(qǐng)根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn) 需求選擇洗脫方案。

注意事項(xiàng)

1) 在進(jìn)行免疫沉淀操作之前，請(qǐng)務(wù)必認(rèn)真閱讀此說(shuō)明書(shū)。

2) 除非另有說(shuō)明，所有操作建議于 4℃下進(jìn)行。

3) 在保證洗雜效果的前提下，如果使用 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced) 洗雜，會(huì)造成抗體和介質(zhì)，或者抗原和抗體之間結(jié)合效果降低，建議 可以使用 1×Lysis/Wash Buffer 進(jìn)行洗雜。

4) 磁珠應(yīng)保存在儲(chǔ)存溶液中，防止干燥，使用前請(qǐng)充分混勻。

5) 如果需要在還原條件下洗脫，向 1× 電泳上樣緩沖液中加入 DTT ( 終濃度10-20 mM)。

6) 經(jīng)煮沸后的填料易聚集并且失去抗體結(jié)合能力，經(jīng)煮沸的填料不應(yīng)再次使用。

7) 為保證最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)選擇特異性較強(qiáng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。

8) 對(duì)于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，不同類型的抗體與抗原結(jié)合的親和性是有區(qū)別的，抗體與抗原結(jié)合還會(huì)受到的影響，因此，若本試劑盒提供的緩沖體系不能獲得很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可自行優(yōu)化緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

9) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，建議加入對(duì)照組，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

10) 在確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果前，建議保留各步驟抗原、抗體孵育后的樣品以備驗(yàn)證。

11）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 常見(jiàn)問(wèn)題