產品簡介

本產品中 M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆轉錄酶是通過基因重組技術克隆表達的一種重組 DNA 聚合酶,可從單鏈 RNA，DNA 或 RNA：DNA 雜合體合成互補的 DNA 鏈。與 AMV 相比，M-MLV 缺乏 DNA 核酸內切酶活性，而 RNase H 活性較低。M-MLV 在 37°C 時具有最佳活性,延伸能力強，可用于合成最大 7 kb 的 cDNA。

本產品以最恰當比例混合的 Primer 混合液，對于不同長度的目標片段，只需要 15-20 分鐘就能夠對目標片段進行高效率的逆轉錄反應。

本產品所含成分對于 Real-time PCR 反應體系無影響，反應曲線表現良好。

產品組成

儲存及運輸條件：-20℃保存；干冰運輸。

質量控制:經檢測無外源核酸酶活性。

※活性定義：以 Poly（A）﹒Oligo（dT）為模板/引物，在 37℃、10 分鐘條件下，摻入 1 nmol 的 [3H] dTTP 所需要的酶量定義為 1 個活性單位（U）。

※活性檢測條件：50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，40 mM KCl, 6 mM MgCl2， 1 mM DTT，0.5 mM [3H]dTTP,，0.1 mM poly(A),，0.1 mM oligo(dT)12-18,，0.1 mg/ml BSA,，M-MLV，Total volume 50 µl ，10 min at 37°C 。

使用方法

1. 去除基因組 DNA 反應。

去除 RNA 溶液中的基因組 DNA，可參考使用本公司產品 Recombinant DNase I（Cat.#FS0359）;若確定所用 RNA 已去除基因組 DNA,則直接進行下一步。

2. RNA 的變性。

把 RNA 在 65℃條件下進行溫浴 5 分鐘，立即置于冰上冷卻。

[注]：溫浴對于容易形成高級結構的 RNA 可以提高逆轉錄的效率。

立即置于冰上冷卻防止 RNA 緩慢冷卻時復性，重新形成高級結構。

溫浴時請勿加入酶和 5xReaction Buffer

3. 逆轉錄體系的配制。

按如下成分于冰上配制反應混合液，為了保證反應液配制的準確性，進行各項反應時，應先按

反應數+2 的量配制 Master Mix，然后再分裝到每個反應管中，最后加入 RNA 樣品。 

[注]：配置體系混勻后簡短離心，以使反應液集中于反應管底。

反應體系可按需求相應放大。

Random 和 Oligo（dT）Primer 同時使用，可有效地將全長 mRNA 反轉錄成 cDNA。

使用單引物進行反轉錄時，建議 10μ?體系使用量分別為：

Random Primer           50pmol,

Oligo（dT）Primer       25pmol,

Gene specific primer      1pmol。

4. 逆轉錄反應。 

在 37℃條件下，進行 15 min 的逆轉錄反應。

在使用基因特異性引物的情況下，特別是使用相同序列的逆轉錄引物和 PCR 引物的時候，在逆轉錄反應時的非特異性退火是導致 PCR 非特異性擴增產物產生的原因。此時，提高逆轉錄反應的溫度至 50-55℃可得到改善。

5. 逆轉錄酶的失活。 

在 85℃條件下，進行 5 sec 的酶失活反應。

反應結束之后，請于 4℃或者 -20℃條件下保存。在進行后續的 Realtime PCR 反應時，根據實際進行反應液的添加，添加體積一般不應超過 PCR 反應體系的 20%。過量的添加逆轉錄反應液，會降低 PCR 的反應效率，不能進行準確的定量。

五、注意事項

1)分取試劑時務必使用新的槍頭（Tip），以防止樣品間污染，同時，要使用精確、量程適合的移液槍。

2)當同時需要進行數次反應時，應先配制各種試劑的混合液，然后再分裝到每個反應管中，可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，同時也可以減少實驗操作或實驗之間產生的誤差。

3)為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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