Real time PCR 技術(shù)服務(wù) 詳細(xì)描述

 熒光定量PCR概述

　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個(gè)能對核酸分子進(jìn)行精確定量的有力工具。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種具有革命性意義的定量PCR技術(shù)。所謂實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。

　　目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關(guān)鍵詞的文章就達(dá)1000多篇。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)較之以前的以終點(diǎn)法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有無與倫比的優(yōu)勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

復(fù)申為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成。

1、主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

（1）．根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物

（2）．客戶樣品RNA抽提：

（3）．RNA質(zhì)量檢測

（4）．逆轉(zhuǎn)錄為CDNA

（5）．制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

（6）．Real time PCR擴(kuò)增

（7）．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2、服務(wù)須知：

（1）.您可自備引物，亦可委托我們設(shè)計(jì)合成（費(fèi)用由客戶承擔(dān)）。自備引物必須是PAGE純化的高質(zhì)量的干粉，我們不接受已溶解的引物。內(nèi)參及SYBR Green染料我公司提供。

（2）.樣本要求：盡可能新鮮

（3）.樣本量：組織樣本，質(zhì)量≥150mg；細(xì)胞樣本，細(xì)胞數(shù)≥1×107。樣本制備及注意事項(xiàng):

①懸浮細(xì)胞： 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液倒入離心管中，離心沉淀細(xì)胞，棄去上清液。加入1ml PBS懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入小離心管中，低速離心沉淀細(xì)胞，棄去PBS，將細(xì)胞沉淀（1×107個(gè)細(xì)胞）放入-70℃ 冰箱保存。干冰運(yùn)輸。也可以在細(xì)胞沉淀中加入1ml的 Trizol 裂解液反復(fù)吸打幾次，目視可見細(xì)胞層溶解完全后，-70℃保存效果更佳。

②貼壁細(xì)胞：取大約1×107個(gè)貼壁細(xì)胞，胰酶消化后加入PBS懸浮細(xì)胞，低速離心收集，棄去液體，加入 1 ml PBS懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入小離心管中，低速離心沉淀細(xì)胞，棄去PBS，放入-70℃冰箱保存。干冰運(yùn)輸。也可以在細(xì)胞沉淀中加入1ml的 Trizol 裂解液反復(fù)吸打幾次，目視可見細(xì)胞層溶解完全后，-70℃保存效果更佳。

③組織：采集新鮮組織（注意：生物體死亡后1分鐘內(nèi)取材料并保存好），組織塊以PBS或生理鹽水清洗干凈，切為小塊，放入液氮或-70℃冰箱中保存，干冰運(yùn)輸。也可每 50-100 mg 組織加1 ml Trizol溶液勻漿裂解組織樣品。勻漿的裂解液4℃ 短期保存（1個(gè)月）。-20℃或-70℃長期保存。

（4）.我公司不接受您提供的RNA樣品，除非您有足夠的證據(jù)證明所提供的RNA沒有問題。

3、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及費(fèi)用：

    復(fù)申生物為您提供準(zhǔn)確、快速的實(shí)時(shí)定量檢測服務(wù)，特異性強(qiáng)、靈敏度高。