Westen Blot實驗的內(nèi)參選什么，看完就懂了！
發(fā)布日期：2025/2/7 16:23:07
Western Blot實驗常用于定性分析表達(dá)產(chǎn)物，以及檢測樣本中蛋白相對表達(dá)量。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中要求有良好的參照體系，包括分子量Marker，陽性參照蛋白以及內(nèi)參。內(nèi)參蛋白主要是一些管家基因，在多種組織和細(xì)胞中高水平表達(dá)，且表達(dá)相對恒定。根據(jù)檢測樣本內(nèi)參的量，可以校正上樣誤差，使結(jié)果可信。
目前在實驗中比較常用的內(nèi)參基因主要為GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）。
（1）GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是在細(xì)胞代謝糖酵解中起關(guān)鍵作用的酶，由4個30-40kDa的亞基組成，檢測條帶大約在36kDa，通常表達(dá)量較高，在相同的細(xì)胞或組織中的表達(dá)量比較恒定。但是在缺氧和糖尿病等疾病情況中，GAPDH表達(dá)可能會發(fā)生變化，因此在這些情況下不推薦作為內(nèi)參。
（2）Actin（肌動蛋白）Actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要蛋白之一。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-actin，檢測條帶大約在分子量42kDa。在許多真核細(xì)胞中都有廣泛且穩(wěn)定的表達(dá)，適用于全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)樣品。
（3）Tubulin（微管蛋白）Tubulin是構(gòu)成微管網(wǎng)絡(luò)的重要蛋白。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-tubulin，檢測條帶大約在55 kDa。微管蛋白與維持細(xì)胞形態(tài)和分裂過程有關(guān)，因此它的表達(dá)水平可能受細(xì)胞狀態(tài)變化的影響。抗生素和抗有絲分裂耐藥的細(xì)胞，Tubulin微管蛋白表達(dá)可能存在差異，即耐藥性研究可能不建議用Tubulin作為內(nèi)參蛋白。
（4）PCNA增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen簡稱PCNA）由Miyachi等于1978年在 SLE（系統(tǒng)性紅斑狼瘡）患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，因其只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)而得名。PCNA是一種分子量為36KD的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核內(nèi)，為DNA聚合酶的輔助蛋白。由于其在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，因此其抗體被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞核蛋白的內(nèi)參抗體。
在保證上樣量一致的情況下，相對于對照組，實驗組目的蛋白的表達(dá)水平是否有差異。挑選原則如下：
1、針對樣本而言首先考慮樣品的物種來源、目的蛋白的表達(dá)部位例如全細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或者血清 、血漿樣本等。
一般地，哺乳動物的細(xì)胞或者組織樣本選擇GAPDH、actin、tubulin（全細(xì)胞）、ATP1A1（細(xì)胞膜蛋白）、Histone H3（核蛋白）、Lamin（細(xì)胞核摸）、COX412（線粒體）、Albumin（全血、血漿、血清）作內(nèi)參。而一些稀有物種具體需要通過查閱文獻(xiàn)選擇比較保守的管家基因作為蛋白內(nèi)參。
2、蛋白分子量選擇
（1）原則上選擇的內(nèi)參與通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 KDa以上例如PTEN(47-55KDa)，此時內(nèi)參選擇GAPDH比較合適，NF-κb（65-70KDa）,此時β-actin較合適，GAPDH也可以；另外若是分子量為42-45kDa，此時不適宜選擇β-actin 作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或β-tubulin作為內(nèi)參。另外兩種內(nèi)參也是相同情況。
下圖不同內(nèi)參的分子量大小
（2）內(nèi)參和目的蛋白也不是相差越大越好
①轉(zhuǎn)膜時間不好控制，若內(nèi)參太小，目的蛋白太大，會導(dǎo)致內(nèi)參轉(zhuǎn)膜過度或者目的蛋白未完全轉(zhuǎn)上。此情況需要分開轉(zhuǎn)膜。
②保證穩(wěn)定性，內(nèi)參蛋白需要在不同樣本中穩(wěn)定表達(dá)，以確保實驗結(jié)果的可靠性。如果內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平與目的蛋白相差過大，可能會對目的蛋白的檢測產(chǎn)生干擾。
③另外若是同時處理多個樣本，將目的蛋白和內(nèi)參分開進(jìn)行檢測可以同時處理多個樣本，提高實驗效率。如果內(nèi)參和目的蛋白的表達(dá)水平相差過大，可能需要調(diào)整上樣量和抗體濃度，這可能會降低實驗效率。
3、細(xì)胞 、組織特異性在選擇內(nèi)參時，在考量實驗條件和研究背景下，不同的細(xì)胞類型和實驗?zāi)康目赡苄枰煌膬?nèi)參。
例如我們在做多細(xì)胞、多組織樣本或者動物實驗樣本對比表達(dá)量時，GAPDH作為內(nèi)參是比較合適，因為GAPDH作為細(xì)胞代謝過程中 關(guān)鍵酶類蛋白，在組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是細(xì)胞骨架成分的 結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會有差異性。
4、內(nèi)參帶條齊、目的蛋白有趨勢基本前提：
（1）內(nèi)參選擇正確（2）上樣量一致注意事項：目前我們在進(jìn)行Westen blot實驗室傾向于裁剪NC膜或者PVDF以減少整膜孵育抗體和洗膜的麻煩。根據(jù)經(jīng)驗來看，內(nèi)參抗體和目的蛋白抗體的蛋白分子量可能處于一個區(qū)間并不是一個準(zhǔn)確的位置，即存在理論位置和實際觀察位置 ，在閱讀抗體說明書時我們一般會使用抗體的實際觀察位置，否則就會因裁膜不當(dāng)造成條帶不全，或者條帶位置不正確。但是近些年許多雜志都要求整膜不允許裁膜，所以在裁膜孵育抗體必須考慮清楚。
目前在實驗中比較常用的內(nèi)參基因主要為GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）。
（1）GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是在細(xì)胞代謝糖酵解中起關(guān)鍵作用的酶，由4個30-40kDa的亞基組成，檢測條帶大約在36kDa，通常表達(dá)量較高，在相同的細(xì)胞或組織中的表達(dá)量比較恒定。但是在缺氧和糖尿病等疾病情況中，GAPDH表達(dá)可能會發(fā)生變化，因此在這些情況下不推薦作為內(nèi)參。
（2）Actin（肌動蛋白）Actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要蛋白之一。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-actin，檢測條帶大約在分子量42kDa。在許多真核細(xì)胞中都有廣泛且穩(wěn)定的表達(dá)，適用于全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)樣品。
（3）Tubulin（微管蛋白）Tubulin是構(gòu)成微管網(wǎng)絡(luò)的重要蛋白。最常用作內(nèi)參蛋白的是β-tubulin，檢測條帶大約在55 kDa。微管蛋白與維持細(xì)胞形態(tài)和分裂過程有關(guān)，因此它的表達(dá)水平可能受細(xì)胞狀態(tài)變化的影響。抗生素和抗有絲分裂耐藥的細(xì)胞，Tubulin微管蛋白表達(dá)可能存在差異，即耐藥性研究可能不建議用Tubulin作為內(nèi)參蛋白。
（4）PCNA增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen簡稱PCNA）由Miyachi等于1978年在 SLE（系統(tǒng)性紅斑狼瘡）患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，因其只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)而得名。PCNA是一種分子量為36KD的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核內(nèi)，為DNA聚合酶的輔助蛋白。由于其在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，因此其抗體被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞核蛋白的內(nèi)參抗體。
在保證上樣量一致的情況下，相對于對照組，實驗組目的蛋白的表達(dá)水平是否有差異。挑選原則如下：
1、針對樣本而言首先考慮樣品的物種來源、目的蛋白的表達(dá)部位例如全細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或者血清 、血漿樣本等。
一般地，哺乳動物的細(xì)胞或者組織樣本選擇GAPDH、actin、tubulin（全細(xì)胞）、ATP1A1（細(xì)胞膜蛋白）、Histone H3（核蛋白）、Lamin（細(xì)胞核摸）、COX412（線粒體）、Albumin（全血、血漿、血清）作內(nèi)參。而一些稀有物種具體需要通過查閱文獻(xiàn)選擇比較保守的管家基因作為蛋白內(nèi)參。
2、蛋白分子量選擇
（1）原則上選擇的內(nèi)參與通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 KDa以上例如PTEN(47-55KDa)，此時內(nèi)參選擇GAPDH比較合適，NF-κb（65-70KDa）,此時β-actin較合適，GAPDH也可以；另外若是分子量為42-45kDa，此時不適宜選擇β-actin 作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或β-tubulin作為內(nèi)參。另外兩種內(nèi)參也是相同情況。
下圖不同內(nèi)參的分子量大小
（2）內(nèi)參和目的蛋白也不是相差越大越好
①轉(zhuǎn)膜時間不好控制，若內(nèi)參太小，目的蛋白太大，會導(dǎo)致內(nèi)參轉(zhuǎn)膜過度或者目的蛋白未完全轉(zhuǎn)上。此情況需要分開轉(zhuǎn)膜。
②保證穩(wěn)定性，內(nèi)參蛋白需要在不同樣本中穩(wěn)定表達(dá)，以確保實驗結(jié)果的可靠性。如果內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平與目的蛋白相差過大，可能會對目的蛋白的檢測產(chǎn)生干擾。
③另外若是同時處理多個樣本，將目的蛋白和內(nèi)參分開進(jìn)行檢測可以同時處理多個樣本，提高實驗效率。如果內(nèi)參和目的蛋白的表達(dá)水平相差過大，可能需要調(diào)整上樣量和抗體濃度，這可能會降低實驗效率。
3、細(xì)胞 、組織特異性在選擇內(nèi)參時，在考量實驗條件和研究背景下，不同的細(xì)胞類型和實驗?zāi)康目赡苄枰煌膬?nèi)參。
例如我們在做多細(xì)胞、多組織樣本或者動物實驗樣本對比表達(dá)量時，GAPDH作為內(nèi)參是比較合適，因為GAPDH作為細(xì)胞代謝過程中 關(guān)鍵酶類蛋白，在組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是細(xì)胞骨架成分的 結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會有差異性。
4、內(nèi)參帶條齊、目的蛋白有趨勢基本前提：
（1）內(nèi)參選擇正確（2）上樣量一致注意事項：目前我們在進(jìn)行Westen blot實驗室傾向于裁剪NC膜或者PVDF以減少整膜孵育抗體和洗膜的麻煩。根據(jù)經(jīng)驗來看，內(nèi)參抗體和目的蛋白抗體的蛋白分子量可能處于一個區(qū)間并不是一個準(zhǔn)確的位置，即存在理論位置和實際觀察位置 ，在閱讀抗體說明書時我們一般會使用抗體的實際觀察位置，否則就會因裁膜不當(dāng)造成條帶不全，或者條帶位置不正確。但是近些年許多雜志都要求整膜不允許裁膜，所以在裁膜孵育抗體必須考慮清楚。
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