產品描述

堿性磷酸酶（Phosphatase, Alkaline，ALP/AP/AKP/ALKP/ALPase，EC 3.1.3.1），堿性條件下能催化磷酸單酯水解，常見底物有對硝基苯酚磷酸鹽（pNPP）、磷酸苯酯、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、腺苷-5-磷酸等。常見ALP包括腸道堿性磷酸酶（如小牛腸來源，calf intestinal）、胎盤堿性磷酸酶（placental alkaline phosphatase）、非組織特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific isozyme, alkaline phosphatase）等。

堿性磷酸酶（ALP）活性的變化與一系列生理和病理事件緊密關聯，比如骨骼發育、骨骼相關疾病、妊娠相關疾病和炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases）等。正因如此，ALP被用作衡量生理特征或疾病的參照指標。另外，ALP活性檢測在環境監測、食品質量控制等方面也呈現重要作用。如，干細胞如誘導多潛能干細胞iPS，ALP活性很高，則ALP常被用作iPS誘導成功的標志；分化的結腸癌細胞內ALP活性顯著提高，則ALP常被當做結腸癌細胞分化程度的指標（定性/定量）；血清中ALP水平提高，被稱作高堿性磷酸酶血癥，此癥狀被認為和惡性膽管阻塞、原發性膽管硬化、原發性硬化膽管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝膽疾病密切相關；ALP是成骨細胞的副產物，血清中ALP活性升高和骨頭發育密切關聯；

本試劑盒能對細胞或組織裂解液或勻漿液、血清、血漿、尿液等樣品內源性堿性磷酸酶活性進行檢測。原理在于：對硝基苯酚磷酸鹽（pNPP）是一種常用的堿性磷酸酶（ALP）顯色底物，堿性條件下能被ALP催化生成對硝基酚（para-nitrophenol，p-nitrophenol），呈黃色產物，可在400-415nm檢測到吸光度。產物黃色越深，代表ALP活性越高，反之則酶活性越低。則通過比色分析可定量檢測ALP水平。

本試劑盒可檢測100個樣品，包括標準品和空白對照。

產品組成

保存與運輸方法

保存：-20℃凍存，1年穩定。

運輸：冰袋運輸。

操作步驟

1. 試劑準備：將所有試劑取出，恢復至室溫待用。

a) 顯色底物溶液：取一管顯色底物，溶解于2.5ml的檢測緩沖液中，充分溶解和混勻，冰上放置。新鮮配制的顯色底物溶液需在數小時（≤ 6h）內使用。

b) 標準品工作液：取10μl 對硝基苯酚標準品（10mM），用檢測緩沖液稀釋至200μl ，使得終濃度為0.5mM。

2. 樣品準備

a) 細胞或組織裂解液的準備：采用適當細胞或組織裂解液裂解細胞和組織，如有必要需進行適當勻漿，隨后離心取上清，用于ALP活性檢測。【注意】：裂解液中不能含磷酸酶抑制劑。樣品可-80℃凍存，避免反復凍融。

b) 血漿、血清和尿液的準備：血漿和血清按照常規方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設置加了血漿或血清但不加底物的對照。【注意】：血漿制備不能用含EDTA和檸檬酸鹽的抗凝管。尿液通常也可直接用于測定。上述樣品可-80℃凍存，避免反復凍融。

c) 樣品的稀釋：若樣品中含有較高的ALP活性，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以用試劑盒中的檢測緩沖液進行稀釋。若使用試劑盒內的檢測緩沖液進行稀釋，需注意保留足夠的緩沖液用于該試劑盒的檢測過程。

3．加樣

參考下表使用96孔板設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。標準品的用量分別為4、8、16、24、32和 40μl，樣品通常可以直接加50μl。如果樣品中的ALP活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定。

4. 混勻：用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進行混勻。
5. 孵育：37℃孵育5-10min。（若待測樣品中ALP活性較低時，可適當延長孵育時間至30min）

6. 終止：每孔加入100μl反應終止液終止反應。此時，標準品或有ALP活性的孔會呈現不同深淺的黃色。

7. 檢測：405nm處測定吸光度。如果不能測定405nm，也可以在400-415nm范圍內檢測吸光度。如果不能立即測定，可以在數小時內完成測定，所顯現的黃色在數小時內穩定。

8. 單位定義：

堿性磷酸酶活性單位的定義：在pH9.8的二乙醇胺（DEA）緩沖液中，37℃條件下，每min水解pNPP顯色底物產生1μM對硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個DEA酶活力單位。在pH9.6的甘氨酸緩沖液中，25℃條件下，每min水解pNPP顯色底物產生1μM對硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定義為一個酶活力單位，也被稱作一個甘氨酸酶活力單位。一個甘氨酸酶活力單位約相當于3個DEA酶活力單位。本試劑盒測定的是DEA酶活力單位。

9. 結果分析：根據酶活性單位的定義，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。 

注意事項

1. 若希望進行酶活力的絕對定量，進行酶反應時必須注意精確計時。此時推薦孵育30min等較長時間，以減小操作過程中的時間誤差。若樣品中酶活性較高，則可預先適當稀釋樣品。

2. 樣品溶液中須避免出現EDTA、氟離子、檸檬酸鹽等堿性磷酸酶抑制劑。

3. 檢測緩沖液和對硝基苯酚標準品對人體有害，請注意適當防護。反應終止液有腐蝕性，請小心操作。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題

1.   說明書提及配制好的顯色底物溶液需在6小時內使用完。試劑盒只提供了兩管顯色底物，是不是意味

著只能做兩次？

回答：是的。顯色底物以粉末形式提供，單次實驗需取一管全部配成顯色底物溶液，且需要在6小時內用完，不建議凍存后再使用。為了避免試劑盒浪費，請在累積足夠的樣本后再進行檢測。

2.   本試劑盒適用于細胞培養上清內堿性磷酸酶的檢測嗎？

回答：不可以。本試劑盒常用于細胞裂解液的檢測，不適合細胞培養上清的檢測，因為上清內的酶量偏低，不足以被本試劑盒檢測到，無法反映真實結果。

3.   本試劑盒內提及合適的細胞和組織裂解液，有沒有推薦的？

回答：推薦使用我司的免疫印跡及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制劑）（Cat#: FS1008-100ML）。或自行配制含0.2% Triton X-100的PBS，TBS或生理鹽水等適當溶液。裂解液內不能含任何磷酸酶抑制劑。

4.   本試劑盒內的堿性磷酸酶活性如何計算所得？

回答：根據標準曲線和待測樣品的吸光值，可計算到樣品中對硝基苯酚（p-Nitrophenol）生成量。再根據酶活性定義：將生成的對硝基苯酚摩爾量除以孵育時間，進行酶活計算。制作標準曲線時，可以將橫坐標體積轉換算成摩爾數，再繪制標準曲線，方便后續計算。根據標準曲線方程計算出生成的對硝基苯酚摩爾量除以37℃孵育的時間即得到酶活。