產品簡介

磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內側翻向細胞膜外側，使PS暴露在細胞膜外表面。而Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

本產品將Annexin V進行熒光素（APC）標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，而7-氨基放線菌素D（7-Amino Actinomycin D, 7-AAD）可與雙鏈 DNA 特異性結合并產生強烈的熒光，與Annexin V搭配使用，可區分處于不同凋亡時期的細胞。

產品組成

保存及運輸：2-8℃避光保存，至少1年有效。試劑A:Annexin V-APC禁止冷凍保存，運輸：冰袋運輸

試劑配制

1×Annexin V Binding Buffer：取 1 mL Annexin V Binding Buffer (10×)加入 9 mL 去離子水中混勻。（去離子水需自備）

使用方法

一步法

1．細胞按照實驗方案進行凋亡誘導，300 ×g 離心 5 min，棄上清，收集細胞，PBS 洗滌一次，輕輕重懸細胞并計數。

2．取 1~5 × 10⁵ 重懸的細胞，300 ×g 離心5 min，棄上清。用 PBS洗滌細胞一次，離心后棄上清，加入500 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer 重懸細胞。

3．細胞懸液中加入5 μL的Annexin V-APC Reagent 和 5 μL 的 7-AAD Reagent (100μg/mL)。

4．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于 1 小時內完成檢測。

【注】流式細胞儀檢測時 Annexin V-APC 可用 APC 通道，7-AAD 選擇 PerCP/Cy5.5 通道。

兩步法

1．細胞按照實驗方案進行凋亡誘導，300 ×g 離心 5 min，棄上清，收集細胞，PBS 洗滌一次，輕輕重懸細胞并計數。

2．取1~5 × 10⁵ 重懸的細胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用 PBS 洗滌細胞一次，離心后棄上清，加入100 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細胞。

3．細胞懸液中加入 2.5 μL 的 Annexin V-APC Reagent 和 2.5 μL 的 7-AAD Reagent (100μg/mL)。（由于兩步法分辨率更高，染色液用量減半依然可得到媲美一步法的效果；用戶亦可根據自己的模型進行滴定后加入適量的染色液，用更少的量獲得高質量的結果。）

4．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．加入 400 μL 稀釋的 1 × Annexin V Binding Buffer，混勻樣本。

6．立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內完成檢測。

【注】流式細胞儀檢測時 Annexin V-APC 可用 APC 通道，7-AAD 選擇 PerCP/Cy5.5 通道。

結果示例

注意事項

1）檢測貼壁細胞時，需收集誘導凋亡后產生的懸浮細胞，并與后續收集的貼壁細胞一起檢測。

2）本試劑盒推薦使用懸浮培養細胞。如果是貼壁細胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不當，可能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測。可將胰酶消化后細胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。

3）如果使用含 EDTA 的胰酶，收集細胞后應充分清洗，確保 EDTA 被去除干凈。

4）染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。

5）熒光物質均易發生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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