產(chǎn)品簡(jiǎn)介

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些特異性的DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。使得凋亡細(xì)胞的DNA被切割成180~200bp片段，在瓊脂糖凝膠上通常以180~200bp的階梯狀遷移。TdT酶（脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶）將標(biāo)記的dUTP連接到斷裂DNA暴露的3'-OH末端，通過在這些末端添加FITC或Alexa Fluor 488 綠色熒光/Cy3紅色熒光標(biāo)記的dUTP的方式來標(biāo)記晚期凋亡細(xì)胞，從而可以通過熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。

產(chǎn)品組成

保存及運(yùn)輸：-20℃避光保存，至少1年有效，避免反復(fù)凍融。

自備材料：PBS 緩沖液（pH~7.4）； 4%多聚甲醛（in PBS）； ??清?蛋? (BSA) 或正常的?、??清； 70%?醇（?選）；脫蠟溶劑（?蠟切?樣本）

使用方法

一、樣品的準(zhǔn)備：

1) 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

1.1) 可選：準(zhǔn)備?份陰性對(duì)照樣本（加?不含TdT酶的TUNEL反應(yīng)液）。

1.2) PBS清洗細(xì)胞兩次。

1.3) 細(xì)胞固定：加?適量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃放置30 min 。

1.4) PBS 清洗細(xì)胞兩次。

1.5) 通透細(xì)胞：加?冰上預(yù)冷的70%?醇，在-20℃孵育 4 h。細(xì)胞能在70%?醇中-20℃的條件下保存?周。或者細(xì)胞可?配制于PBS中的 0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置 20 min 。

1.6) PBS 清洗細(xì)胞兩次。

2) 石蠟組織切片的準(zhǔn)備： 

2.1）室溫下??甲苯浸泡?蠟組織切?2次，每次5 min，以徹底脫掉?蠟。【注】：?甲苯有毒，易揮發(fā)，請(qǐng)?jiān)谕?/span>風(fēng)櫥中進(jìn)?此操作。

2.2）室溫下，將切?樣本浸沒于???醇中漂洗2次，每次5 min。

2.3）室溫下，將切?樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的?醇（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次 5 min。

2.4）室溫下，將切?浸沒于純?中漂洗1次，每次3 min，再將切?浸沒于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，?濾紙??吸?切?樣本周圍多余液體。

2.5）?免疫組化筆在切?樣本周圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。

2.6）按1:100的?例，將2 mg/mL 的Proteinase K溶液?1 × PBS 稀釋，使其終濃度為20 µg/mL。每個(gè)樣本上滴加 100 µL 稀釋好的Proteinase K溶液，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20 min。（Proteinase K 的孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)?優(yōu)化）。

【注】：蛋?酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切?脫落，所以要最優(yōu)化孵育時(shí)間?短。時(shí)間?般為10~30 min，4 µm 左右的??可以?10 min，但30 µm 左右的可? 30 min。過長易脫?、過短起不到通透效果。

2.7）PBS 浸潤清洗切?兩次，每次5 min，?濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。【注】：這?步必須把蛋?酶K洗滌?凈，否則會(huì)嚴(yán)重?擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

3) 冰凍組織切片樣品的準(zhǔn)備： 

3.1）將冰凍切?放置于室溫的?架上，室溫20 min，晾?。

3.2）將載玻?浸沒在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室溫固定30 min。

3.3）PBS浸潤清洗切?兩次，每次 5 min。

3.4）?濾紙??吸?載玻?上樣本周圍的液體。

3.5）按1:100的?例，將 2 mg/mL 的Proteinase K溶液?1 × PBS 稀釋，使其終濃度為20 µg/mL。每個(gè)樣本上滴加100 µL 稀釋好的Proteinase K溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域， 室溫孵育10 min。Proteinase K 的孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)?優(yōu)化）。

【注】：蛋?酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切?脫落，所以要最優(yōu)化孵育時(shí)間長短。時(shí)間?般為10~30 min，4 µm左右的??可以?10 min，但30 µm 左右的可? 30 min，需摸索最佳時(shí)間。過長易脫?、過短起不到通透效果。

3.6）PBS浸潤清洗切?兩次，每次5 min，?濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。

4）陽性處理(僅陽性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行 TUNEL反應(yīng)步驟)

4.1）按1:10 的?例? ddH₂O將 10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer 備?。

4.2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。

4.3）?1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μ L)， 使其為終濃度20 U/mL的?作液。

4.4）輕輕吸掉多余液體，加?100 μ L濃度為20 U/mL DNase I?作液，室溫孵育10 min。

4.5）輕輕吸掉多余液體，PBS清洗樣品2次

二、配制 TUNEL 檢測(cè)液：

1)預(yù)先配制 TUNEL 反應(yīng)混合液：每個(gè)樣本需要已加? 1 uL TdT 酶的 50 uLTUNEL 反應(yīng)緩沖液。

2)每個(gè)樣本加? 100 μ L TUNEL平衡緩沖液，孵育5 min。

3)棄去平衡緩沖液，?濾紙??吸去切?樣本周圍的多余液體，每個(gè)樣本加?50 μ L TUNEL反應(yīng)混合液。

a)貼壁細(xì)胞，?蓋玻?使緩沖液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育 60 min。

b)懸浮細(xì)胞，可加?微孔板中，采?微孔板振蕩器進(jìn)?孵育或每隔15 min 溫和的震蕩反應(yīng)管，使之充分反應(yīng)。37℃避光孵育60 min。

c)組織樣本，?蓋玻?使緩沖液均勻覆蓋樣本。將樣本平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2?時(shí)，濕盒底部鋪?張含少量?的紙?保持濕度。37℃避光孵育2 h。

4) 去掉反應(yīng)液，在1×PBS的染?缸中浸泡潤洗2次，每次5 min。再使?適量配制于PBS 中的0.1% Triton X-100， 其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本3次，每次5 min，以降低背景。

5) （可選）復(fù)染：每個(gè)樣本滴加濃度為2 μ g/mL 的DAPI染液，避光室溫孵育10 min。染?完后，輕輕去掉染液，并將樣本在1×PBS中浸泡潤洗3次，每次 5 min。

6) （可選）封?：將切?樣本先純?浸沒 5 min，再放?70%?醇浸沒 5 min，再80%?醇浸沒5 min，90%?醇浸沒5 min，95%?醇浸沒5 min，???醇浸沒5 min，最后將切?樣本置于染?缸中以新鮮的?甲苯浸泡透明化處理2次，每次5 min。（通?廚中操作）。脫?完成后，擦去切?周圍的液體，每個(gè)切?樣本滴加50 μ L抗熒光淬滅封?液， 蓋上蓋玻?，?鑷?的鈍端輕輕敲擊蓋玻?，去除?泡以使封 ?完全。

7) ?熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察、分析，AF488是?種綠?熒光染料，激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為485 nm，515 nm(凋亡細(xì)胞應(yīng)被標(biāo)記上明亮的綠?熒光，沒有加?TdT 酶的陰性對(duì)照樣本未被標(biāo)記上熒光)。

注意事項(xiàng)

1）熒光染料均存在淬滅問題，保存和使?過程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）如果使用蛋白酶K處理后，需充分洗滌出掉多余試劑。

3）所以試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

相關(guān)產(chǎn)品