產(chǎn)品簡(jiǎn)介

H2DCFDA(DCFH-DA)，英文全名2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，中文全名2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯，是一種通用的氧化應(yīng)激指示劑。具細(xì)胞膜滲透性，本身無(wú)熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞酯酶水解生成2′,7′-二氯二氫熒光素（2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein, DCFH），之后被快速氧化生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物2′,7′-二氯熒光素（2′,7′-dichlorofluorescein, DCF），可用熒光光譜檢測(cè)（Ex/Em= 504/529nm）。適用于檢測(cè)活性氧（ROS）和一氧化氮（•NO），以及確定總的氧化應(yīng)激水平。普遍用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞氧化還原過(guò)程。

本品以粉末形式提供，可直接溶于無(wú)水DMSO配制成1-10mM儲(chǔ)存液，常用工作濃度1-10μM，需根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)體系或參考文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化。

產(chǎn)品特性

CAS ：4091-99-0

化學(xué)名：Benzoic acid, 2-[3,6-bis(acetyloxy)-2,7-dichloro-9H-xanthen-9-yl]; 2-(2,7-dichloro-3,6-diacetyloxy -9H-xanthen-9-yl)-benzoic acid;

英文同義名：DCFH-DA;2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate;

中文同義名：2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯；

分子式：C₂₄H₁₆Cl₂O₇

分子量：487.29

純度：≥97%

外觀：白色至帶黃色光澤的白色粉末

溶解性：溶于DMSO（25mg/ml）、DMF（25mg/ml）、無(wú)水乙醇（25mg/ml）

使用方法（僅作參考）

以下步驟是來(lái)源于大量文獻(xiàn)總結(jié)的簡(jiǎn)易操作流程，僅作參考。用戶需根據(jù)特定的應(yīng)用和敏感性來(lái)做調(diào)整。

1）將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無(wú)水DMSO或其他有機(jī)溶劑配制成1-10mM儲(chǔ)存液。未用完的DMSO儲(chǔ)存液需分裝并避光凍存在-20℃，避免反復(fù)凍融。

2）于正式實(shí)驗(yàn)前，用生理鹽緩沖液（比如：PBS，HBSS，HEPES）稀釋到工作濃度1-10μM。需根據(jù)具體應(yīng)用來(lái)調(diào)整合適的工作濃度。

3） 吸走培養(yǎng)液，加入步驟2）配制的染色工作液到細(xì)胞內(nèi)，室溫或30℃孵育5~60min。

4） 吸走染色工作液，用預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液清洗一遍。重新加入預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液，在適宜溫度內(nèi)孵育。對(duì)于二乙酸酯衍生物，需要短暫復(fù)原時(shí)間讓細(xì)胞內(nèi)酯酶將其水解，從而讓染料對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)。最佳的復(fù)原時(shí)間范圍很廣，由于某些細(xì)胞類(lèi)型通常顯示極其低水平的酯酶活性。

5） 將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)刺激物之前，先測(cè)定加載細(xì)胞的背景熒光強(qiáng)度。

6） 根據(jù)以下情況評(píng)估陰性對(duì)照（Negative control），

6.1) 綠色發(fā)射光譜內(nèi)檢查未染色細(xì)胞的自熒光情況。

6.2) 對(duì)于流式分析，查明染料加載和處理后細(xì)胞的前向角散射和側(cè)向角散射是不變。細(xì)胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應(yīng)引起的。

6.3) 對(duì)包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無(wú)細(xì)胞混合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。在不含細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著時(shí)間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。

6.4) 檢查培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)液或簡(jiǎn)單緩沖液內(nèi)的未處理加載細(xì)胞（對(duì)照）的熒光。在健康細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酶和/或天然抗氧化劑會(huì)清除這些氧自由基。經(jīng)過(guò)染料加載復(fù)原時(shí)間后，健康細(xì)胞應(yīng)該表現(xiàn)出低水平的熒光信號(hào)，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間相對(duì)穩(wěn)定。然而，逐漸增加（由于自氧化）或降低（由于細(xì)胞內(nèi)染料喪失或光淬滅）也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導(dǎo)劑的體系內(nèi)，健康和未處理細(xì)胞突然發(fā)現(xiàn)強(qiáng)熒光，表明細(xì)胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。

7） 建立陽(yáng)性對(duì)照（Positive control），可能用以下方法刺激氧化活性：

7.1) 腫瘤促進(jìn)劑（PMA，工作濃度100pM~10μM）

7.2 )H2O2或TBHP（終濃度~100μM）（根據(jù)細(xì)胞本身對(duì)其的靈敏度和反應(yīng)性來(lái)提高或降低濃度）

8） 確保刺激藥物或化合物不會(huì)引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會(huì)與氧化后染料的最大激發(fā)或發(fā)射光譜發(fā)生重疊。

注意事項(xiàng)

1） 有機(jī)溶劑如DMSO儲(chǔ)存液需分裝成單次用量后，-20ºC避光保存，避免反復(fù)凍融。

2） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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