產(chǎn)品描述：

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，或ROS Assay Kit）是一種利用熒光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate）進行細胞內(nèi)活性氧水平檢測的常用方法。檢測原理在于DCFH-DA本身無熒光，能自由穿過細胞膜，一旦進入細胞后，被胞內(nèi)的酯酶水解生成無熒光的DCFH。DCFH不能穿透細胞膜，從而保留在胞內(nèi)。此時胞內(nèi)的活性氧可以氧化DCFH生成有熒光的DCF。通過DCF熒光的強弱即可反映活性氧的水平。

本試劑盒包含活性氧陽性對照Rosup，利于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/ml。因檢測對象和反應(yīng)體系的不同，本試劑盒可檢測100-500個樣品。

產(chǎn)品組成：

 組分編號        組分名稱                                            規(guī)格            儲存方法

 FS1176S-A 活性氧探針DCFH-DA（10mM）               0.1ml    -20℃避光保存

 FS1176S-B 活性氧陽性對照（Rosup, 50mg/ml）        1ml       -20℃保存

保存與運輸方法：-20ºC保存，有效期一年。運輸：冰袋運輸。

使用方法

1. 裝載探針

【注意】：對于刺激時間較短（通常2h以內(nèi)）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照Rosup和/或待研究藥物刺激細胞；對于刺激時間較長（通常6h以上）的細胞，先用活性氧陽性對照Rosup或待研究藥物刺激細胞，后裝載探針。

1.1 原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

1）檢測前一天進行細胞鋪板，確保活性氧檢測當天細胞匯合率達到50~70%。

2）吸出細胞培養(yǎng)液，加入適量體積以及濃度的待研究藥物，于37ºC細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，具體誘導時間根據(jù)細胞類型和藥物自身特性決定。

【可選】陽性對照Rosup：先用無血清培養(yǎng)液按照1:1000比例稀釋陽性對照，通常37℃培養(yǎng)箱內(nèi)刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異【刺激時間可參考文獻或?qū)嶒灲?jīng)驗來調(diào)整】。如果刺激后30min內(nèi)未觀察到活性氧水平升高，可以適當提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過快，則適當降低Rosup的工作濃度。

3）按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。吸出細胞培養(yǎng)液，加入適當體積DCFH-DA工作液。【注意】：加入體積以能充分蓋住細胞為宜。對于6孔板，每個孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。對于96孔板，每個孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4）37ºC細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。

5）用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2 收集細胞后裝載探針

1）按照常規(guī)方法，清洗并收集足量的細胞。【注意】：保證細胞的狀態(tài)健康。

2）用適量體積以及濃度的待研究藥物重新懸浮細胞，于37ºC細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，具體誘導時間根據(jù)細胞類型和藥物自身特性決定。【可選】陽性對照Rosup：先用無血清培養(yǎng)液按照1:1000比例稀釋陽性對照，通常37℃培養(yǎng)箱內(nèi)刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異【刺激時間可參考文獻或?qū)嶒灲?jīng)驗來調(diào)整】。如果刺激后30min內(nèi)未觀察到活性氧水平升高，可以適當提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過快，則適當降低Rosup的工作濃度。

3）探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。

4）離心，吸出細胞內(nèi)刺激藥物，之后用適量DCFH-DA工作液重懸細胞，使得細胞密度為1×10⁶~2×107/ml。【注意】：細胞密度需根據(jù)后續(xù)檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來調(diào)整。例如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細胞數(shù)目控制在10⁴~ 10⁶之間。

5）37ºC細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。每隔3~5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

6）用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。

2. 檢測

2.1 原位裝載法

可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

2.2 收集細胞后裝載法

可用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3. 參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。

4. 其他說明

1）對于某些細胞，若發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000～1:5000稀釋DCFH-DA，使DCFH-DA的工作濃度為2～5μM。探針裝載時間也可依情況在15～60min內(nèi)適當進行調(diào)整。

2）Rosup僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入Rosup陽性對照。

注意事項

1）探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導致背景較高。

2）探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。

3）盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。