產品簡介
    PKH26是一種膜標記探針,結構上帶有-長脂肪族尾巴，能穩定插入細胞膜脂質區域。PKH26熒光處于黃橙色光譜區間(見圖1) , 最大激發波長為551nm,最大發射波長是567nm ,與羅丹明或PE檢測系統兼容。也可能用標準熒光素( Fluorescein)激發濾片,但熒光強度可能會有些降低。PKH26具 最長的體內半衰期，超過100天。

本產品PKH26熒光細胞連接試劑盒采用擁有專利的膜標記技術，專利膜標記技術，穩定的與細胞膜脂質區結合并發出紅色熒光，染色方式依賴于細胞與膜的類型，主要用于外泌體染色、細胞體外標記、體外細胞增殖研究及體內外細胞示示蹤研究。

PKH26外泌體染色也是一種常用的技術，用于標記外泌體的膜表面。外泌體是一類細胞分泌的小囊泡，其中含有多種生物活性物質，如蛋白質、核酸和脂質，可以在體內和體外傳遞信號并參與細胞間通訊。通過PKH26染色，可以標記外泌體表面，使其產生紅色熒光信號，從而方便對外泌體的追蹤和研究。PKH26外泌體染色的優勢在于其持久、穩定和高亮度的熒光信號，使得標記的外泌體可以在長期觀察中保持熒光，便于對外泌體的動態行為進行跟蹤。此外，PKH26染料對外泌體膜表面有較高的親和力，具有良好的特異性，不會在標記的外泌體外部產生背景信號。

圖1：

自備材料

1、充分分散的單個細胞懸液

2、含血清的組織培養基（完全培養基）

3、無Ca²⁺，Mg²⁺和血清的培養基或者緩沖鹽（如Dulbecco’s PBS或Hank’s BSS）

4、血清，白蛋白或其它組織兼容性蛋白

5、離心管（4-15mL）

6、溫控離心機（1,000×g）

7、熒光分析設備（熒光讀板機，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）

8、層流罩

9、血球計數板或細胞計數器

10、載玻片和蓋玻片

操作方法（下列過程最終體積為2mL，含2uM PKH26，以及1×10⁷cells/mL細胞濃度）

（以下過程均在室溫下進行（20-25℃）
1. 將2×10⁷個細胞于離心管中，用不含血清培養基洗一遍。

【注意】血清蛋白和脂質會與染料結合，降低與細胞膜結合的染料濃度。最好在用稀釋液C重懸細胞染色前（第四步）用無血清培養基或緩沖液洗細胞一次（第一步）。

2. 400×g離心5分鐘。【注意】PKH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。

3. 離心后，小心吸棄上層清液，剩余上層細  胞液體積不超過25μL。

【注意】為得到可重復的實驗結果，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培養基或緩沖液體積非常重要。

4. 加入1mL稀釋液C用移液管輕輕吹打混勻，制備  2×細胞懸液。不要用振蕩器震蕩，不要讓  細胞在稀釋液C中保存太長時間。

【注意】生理鹽（physiologic salts）的存在會使得染料結團并大幅降低染色效率。因此，需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中，不含培養基或緩沖鹽。

5. 臨染色之前，將4μL PKH26乙醇溶液加  入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的  2×染色液（4×10-6M）。

【注意①】：為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。

【注意②】：如果所需染料最終濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨的容器中，以確保實驗結果的可重復性。

6. 快速將1mL 2×細胞懸液（步驟4）加入  1mL 2×染色液（步驟5）中，立即用移液  管混勻。最終細胞濃度為1×10⁷/mL，PKH26濃度為2×10-6M。

【注意】：由于染色瞬間完成，快速將細胞與染料混勻對得到明亮、均勻和可重復的標記結果非常重要。下列措施有助于得到較優的結果：

a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中。

b. 將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。

c. 調整2×細胞和2×染料的濃度避免染色  體積太小（＜100μL）或太大（＞5mL）。

d. 用電動移液器快速將細胞和染料混勻。  血清移液管混勻速度太慢而使得染色不  均勻。Racking和旋渦震蕩混勻同樣混勻  較慢，染色均一性較差。

e. 分配體積盡量準確，以保證樣品與樣品  之間，實驗與實驗之間的可重復性。

7. 混勻后的染色的細胞孵育1-5 min。由于  染色速度較快，延長孵育時間對實驗沒有幫助。

【注意】：讓細胞在染色液中停留盡量短的時間，同時保證得到理想的染色強度。因為稀釋液C缺少生理性鹽，過長時間的暴露在稀釋液C中會造成某些細胞活力降低。如果不能確定其影響程度，可增加僅作稀釋的對照組和只用乙醇而不用染料染色的對照組。

8. 加入等體積的血清（2mL）或其它合適的蛋白溶液（如1% BSA）終止反應，孵育1min以結合多余的染料。

【注意①】：血清（或等效的蛋白濃度）為最優的終止液。如果用完全培養基替代，添加體積為10mL。

【注意②】：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應。

【注意③】：不要用無血清培養基或緩沖鹽，他們會使染料產生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標記的細胞。

9. 將細胞在20-25℃條件下400×g離心10min，小心吸棄上清。用10mL完全培養基重懸，將重懸液轉移至另一新的無菌離  心管中，20-25℃條件下400×g離心5 min。用10mL完全培養基再清洗兩遍以除去沒  結合的染料。

【注意①】：將重懸液轉移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響；

【注意②】：不要用稀釋液C清洗。

10. 最后一步清洗后，用10mL完全培養基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒 光強度（圖2。離心重懸細胞至所需活細  胞濃度。

【注意①】：染色后的細胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強度至少3周內保持穩定。

【注意②】：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍。雖然染色的CV值與細胞種類有關，但熒光分布應該盡量均勻對稱。

圖2. PKH26染色優化

11、MC-38 TIL細胞用上述指定PKH26濃度染色，最終細胞濃度為1×107/ml。活力（▲）由FITC染色測定，平均熒光強度（●）用流式細胞儀檢測。用20μM PKH26標記后，抗腫瘤TIL特異性和效能沒有改變。

PKH26外泌體染色的參考步驟如下：

①細胞培養：首先收集要研究的細胞培養上清液，其中包含外泌體。

②制備PKH26染色液：將PKH26染料與相應的標記液混合，根據外泌體數量和濃度調整染料的濃度。

③染色反應：將細胞培養上清液與PKH26染色液混合，充分混合后孵育一定時間，使熒光染料與外泌體表面結合。

④終止染色：加入終止染色反應的緩沖液，停止熒光染料的進一步結合。

⑤洗滌和沉淀：用適當的緩沖液洗滌標記的外泌體，去除未結合的熒光染料。

運輸和保存方法
冰袋運輸。2-8℃保存，有效期1年。PKH26乙醇溶液冷藏保存。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊減少蒸發以防止染料濃度升高。

注意事項

1、親脂性染料結合到細胞膜上完成標記。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數，與滲透性無關。因此，保證染料添加量不過量非常關鍵。過標記的細胞將會導致細胞膜完整性缺失或降低細胞活性。

2、本品可用于體內體外細胞的標記，包括干細胞、淋巴細胞、單核細胞、內皮細胞、神經細胞或者任何其他細胞。體內細胞的標記過程需一定的改進，如血小板的染色，或者選擇性標記吞噬細胞。

3、本品染色過程中細胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細胞。使用者需通過評估染色后細胞活率（如，PI染色）、熒光強度、染色均勻度及是否對所研究細胞功能有影響等，根據實驗目的，確定最優的染料濃度和細胞濃度。

4、雖然貼壁細胞也可以染色，但單個懸浮細胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶（trypsin/EDTA）將貼壁細胞消化成單個懸浮細胞后再染色效果更佳。

5、PKH26染色過程中，不能存在疊氮化物或代謝毒性物。

6、熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

7、該染料避光保存，使用前觀察是否有結晶。如出現結晶，室溫防止30min，然后超聲或震蕩直至溶解。

8、稀釋液C可室溫或冷藏保存。如果冷藏保存，使用前復溫至室溫。稀釋液C為無菌溶液，不含任何防腐劑和抗生素，其需保持無菌。不要將染料儲存于稀釋液C中。溶于稀釋液C的工作液需現配現用，且配好后需立即使用。

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