產(chǎn)品描述

PKH67細胞連接試劑盒（用于常規(guī)細胞膜標記）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于熒光探針PKH67，用于常規(guī)細胞膜標記的檢測試劑盒，適用于體外細胞標記，體外細胞增殖以及長期的體內(nèi)細胞跟蹤研究等。

PKH67是一種膜標記探針，與PKH1和PKH2相比，結構上帶有更長的脂肪族碳尾，能穩(wěn)定插入細胞膜脂質(zhì)區(qū)域。正因具更長碳尾，內(nèi)部數(shù)據(jù)連續(xù)性證明：PKH67具有比PKH2更低的細胞-細胞間轉(zhuǎn)運發(fā)生。PKH67呈綠色熒光（見圖1），最大激發(fā)波長為490nm，最大發(fā)射波長是502nm，與標準熒光素（Fluorescein）濾片兼容。PKH67非常適合用于細胞毒性實驗，與碘化丙啶（PI，CAT:#FS1202）或7-氨基放線菌素D（7-AAD，CAT:#FS1213）這些細胞活力探針聯(lián)合使用。根據(jù)染料稀釋原理，PKH67常用于細胞增殖監(jiān)測分析，包括抗原特異性的前體頻率和帶干細胞特性的靜息/緩慢分化腫瘤細胞的鑒定。也能用于監(jiān)測外泌體或脂質(zhì)體吞噬，細胞-細胞膜轉(zhuǎn)運、吞噬、抗原遞呈，以及體內(nèi)細胞運輸研究。

以不分裂細胞為研究對象，通過對體外細胞膜滯留周期和體內(nèi)熒光強度減弱頻率的關聯(lián)性分析，預測PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。這與PKH1和PKH2的體內(nèi)半衰期相近，這兩個探針都成功用于監(jiān)測周期長達1-2個月的體內(nèi)淋巴細胞和巨噬細胞運輸研究，因此，PKH67適用于需要綠色熒光細胞連接染料的短-中期體內(nèi)示蹤研究，以及體外細胞毒性、吞噬、增殖、抗原遞呈，或其它共培養(yǎng)實驗。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一種水溶性溶液，特別設計的一種標記媒介能維持細胞活力，同時最大化染料溶解性和標記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動物細胞來說是等滲的，不含去污劑或有機溶劑，也不含生理鹽和緩沖劑。根據(jù)細胞類型，染料標記后膜的內(nèi)在化程度，標記細胞可能呈現(xiàn)不同的狀態(tài)，從明亮，到均勻點狀或斑駁狀。然而，PKH67熒光在生理范圍內(nèi)不依賴于pH，且每個細胞的熒光強度通常不受染料位置的影響。

圖1. PKH67的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

FUSHENBIO(復申生物)PKH67細胞連接試劑盒Mini Kit其中100UL規(guī)格建議用于小量或初步研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細胞樣本（2×10⁷個細胞/次），和足量的Diluent C用于5次細胞樣本（2×10⁷個細胞/次）；200UL規(guī)格適用于中量研究，比如體外細胞增殖或毒性研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細胞樣本（2×10⁷個細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×10⁷個細胞/次）； 

1ML規(guī)格適用于大量或體內(nèi)研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細胞樣本（2×10⁷個細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×10⁷個細胞/次）。用戶需根據(jù)細胞類型和實驗目的來優(yōu)化確定最佳的染料濃度。

操作步驟

1. 自行準備儀器和試劑（試劑盒不提供，用于常規(guī)細胞膜標記）

﹒良好分散，均勻的單細胞懸液（懸浮于組織培養(yǎng)基）

﹒含血清的組織培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養(yǎng)基，或生理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系統(tǒng)兼容的蛋白

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能控溫的離心機（高達1000×g）

﹒熒光分析用儀器（熒光酶標板，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）

﹒無菌層流凈化罩

﹒血球計數(shù)板或自動細胞計數(shù)裝置

﹒載玻片和蓋玻片

2. 常規(guī)細胞膜標記

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH67，以及1×10⁷個細胞/ml。

以下所有步驟都在室溫下進行（20-25℃）。

1. 取一錐底聚丙烯離心管制備2×10⁷個細胞的單細胞懸浮液，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞一次。

2. 400×g離心細胞5min，得到松散的細胞沉淀。

3. 細胞離心后，輕輕吸掉上清。注意不要移動任何細胞并且殘留不超過25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到細胞沉淀中制備成2×細胞懸液，用槍輕輕吹勻以確保完全分散。不可渦旋和不可讓細胞長期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通過將4μl PKH67乙醇儲存液到1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

6. 快速加1ml2×細胞懸液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本。混勻后樣本得到的終濃度是1×10⁷個細胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的細胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非常快，更長時間無任何益處。

8. 加入等體積（2ml）血清或其他適當?shù)鞍兹芤海ū热?% BSA）終止染色，孵育1min允許結合多余的探針。

9. 20-25℃，400×g離心細胞10min，輕輕吸掉上清，確保不會移動細胞。用10ml完全培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)移到一個干凈無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細胞5min。然后用10ml完全培養(yǎng)基清洗細胞沉淀＞2次，以確保完全去除未結合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，用來評估細胞回收，細胞活力和染色強度。離心和重懸沉淀到一理想終濃度的活細胞懸液。

注意事項

1)  PKH67是以溶于乙醇的儲存液形式提供，保存的過程中需避光并擰緊蓋子，以防止溶液揮發(fā)引起的染料濃度提高。使用前需檢查是否有結晶，若有結晶，需在37℃水浴溶晶，超聲或渦旋直至完全溶解。

2)  Diluent C使用前需置于室溫回溫之后再配制標記用的細胞和染料工作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生素，使用和保存過程中都注意無菌。

3) PKH67不能保存在Diluent C內(nèi)，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4)  熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

5)  為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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