產品簡介

線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE) (Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with TMRE)是一種以TMRE為熒光探針，TMRE是一種可滲透細胞膜的橘紅色陽離子熒光探針，可在完整的線粒體中聚集，而去極化或非活躍性線粒體膜電位降低，導致TMRE積聚減少。能快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測。本試劑盒可使用熒光顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀等熒光檢測系統進行檢測。

本試劑盒檢測線粒體膜電位的原理如下。正常狀態下的線粒體內部存在大量的負電荷，作為陽離子探針的TMRE進入細胞內后可聚集在線粒體基質中，可發出明亮的橘紅色熒光；當細胞發生凋亡時，線粒體膜電位丟失，線粒體通透性轉換孔(MPTP)持續開放，TMRE被釋放到細胞質中，線粒體內橘紅色熒光強度明顯下降。可用熒光顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標儀等儀器檢測細胞，通過熒光信號的強弱來確定線粒體膜電位的變化和凋亡或壞死的發生。

本試劑盒可以應用于大多數的哺乳動物細胞，有報道稱TMRE也可以用于某些酵母如Saccharomyces cerevisiae。由于TMRE在線粒體內的積累依賴于線粒體膜電位，因此本試劑盒僅限用于存活的細胞或組織的檢測，不可用于固定或凍存的細胞或組織的檢測。

本試劑盒提供的TMRE探針在線粒體內的熒光強度隨線粒體膜電位的變化非常敏感，較低的濃度就可以產生明亮的熒光，并且背景清晰，非常適合用于凋亡實驗中高通量檢測線粒體膜電位的變化。

本品為即用型試劑盒形式提供，其中TMRE探針為1000X溶液，該溶液經過優化，對大多數細胞都適用，但為了得到滿意的結果，對于不同類型的細胞請自行進行一定摸索，TMRE的終濃度一般為0.1X-5X，最優先的推薦終濃度為1X。試劑盒提供的CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照，終濃度一般為1-20μM，最優先的推薦終濃度為10μM。同時，本試劑盒提供了檢測緩沖液，該緩沖液可在一段時間內維持細胞的正常狀態，并給細胞提供一定的營養，效果比PBS或HBSS更好。本公司還提供單獨的探針粉末狀態的（貨號CAT#:FS1369）

圖1. TMRE的和激發、發射光譜圖。

產品組成

檢測規格：如果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5ml時，可以進行200次檢測；6孔板每孔檢測體系的體積為1ml時可以檢測100次，96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以檢測1000次。

保存與運輸方法:-20ºC避光干燥保存，至少1年有效。 運輸：冰袋運輸。

產品特性

CAS ：115532-52-0

中文名：TMRE [四甲基羅丹明,乙酯,高氯酸鹽]

英文名：TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]

分子式：C₂₆H₂₇ClN₂O₇

分子量：514.95

純度：≥95%

Ex/Em：550/575nm

溶解性：溶于DMSO

化學結構式：

使用說明
1.儲存液、工作液的制備和保存
以6孔板為例每孔所需TMRE染色工作液的量為1ml，其它培養器皿的TMRE染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50-100萬細胞需0.5ml TMRE染色工作液。取適量TMRE (1000X)，按照每1µl TMRE (1000X)加入1ml檢測緩沖液的比例稀釋TMRE，混勻后即為TMRE染色工作液。
【注①】：配制TMRE染色工作液時注意避光，且須現配現用，不能長期保存。
【注②】：本試劑盒中提供的檢測緩沖液含有Ca2+，能夠在一段時間內維持細胞的正常狀態，并給細胞提供一定的營養，效果比PBS或HBSS更好；檢測緩沖液也可用細胞培養液代替，但培養液中不能含有血清，否則會影響TMRE的染色效果。
【注③】：染色工作液中TMRE的最終濃度需根據不同細胞系和實驗體系通過預實驗進行優化。TMRE的推薦工作濃度為1X，可以在0.1X-5X范圍內摸索最佳工作濃度。
2.陽性對照的設置
把試劑盒中提供的CCCP (10mM)推薦按照1:1000的比例加入到細胞培養液中，稀釋至10µM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法加入TMRE染色工作液，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數細胞，通常10µM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失，TMRE染色后觀察應呈弱紅色或幾乎無熒光；而正常的細胞經TMRE染色后應顯示明亮的紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料或自行摸索確定。
3.對于懸浮細胞
3-1. 細胞按照實驗設計進行一定處理后，計數。取適量細胞600×g室溫離心5min，棄上清，加入適當體積的TMRE染色工作液重懸細胞，使細胞密度約為1×106/ml。
3-2. 細胞培養箱中37℃孵育15-45min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以15min作為初始孵育時間，對孵育時間進行適當優化以得到最佳的效果。
3-3. 37℃孵育結束后，600×g室溫離心5min，沉淀細胞。吸除上清，注意盡量不要觸及細胞。
3-4. 用37℃預熱的細胞培養液洗滌2次：加入1ml 37℃預熱的細胞培養液重懸細胞，600×g離心5分鐘，沉淀細胞，棄上清。再加入1ml 37℃預熱的細胞培養液重懸細胞，600×g離心5分鐘，沉淀細胞，棄上清。
3-5. 再用適量細胞培養液重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光酶標儀或流式細胞儀分析。
4.對于貼壁細胞
【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。熒光酶標儀如果能采用底讀的方式進行熒光檢測，也可以使用96孔板等進行貼壁培養檢測的。
4-1. 對于6孔板的一個孔的細胞，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次。
4-2. 加入1ml TMRE染色工作液。細胞培養箱中37℃孵育15-45min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以15min作為初始孵育時間，對孵育時間進行適當優化以得到最佳的效果。
4-3. 37℃孵育結束后，吸除上清，用預熱的細胞培養液洗滌2次。
4-4. 加入2ml預熱的細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。
4-5. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5.對于純化的線粒體
5-1. 準備好TMRE染色工作液。
5-2. 0.9ml TMRE染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10-100µg純化的線粒體。
5-3. 用熒光酶標儀或熒光分光光度計檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描(time scan)，激發波長為550nm，發射波長為575nm。如果使用熒光酶標儀，可在軟件中把檢測對象設置為Rhodamine或Texas Red，即可以檢測TMRE。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設置進行熒光檢測。
5-4. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。
6.熒光觀測和結果分析
TMRE的最大激發波長為550nm，最大發射波長為575nm。【注意】：此處測定熒光時不必把激發光和發射光波長設置在最大激發波長和最大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，可以參考觀察Rhodamine或Texas Red等其它紅色熒光探針時的設置。紅色熒光變弱說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。通過對比實驗組與陰性對照組測量的Relative fluorescence values (RFU)，可以得出藥物處理后線粒體內TMRE探針熒光強度的變化。此處的陰性對照為僅含檢測緩沖液的未經染色的細胞樣品。

注意事項

1）探針染料存在淬滅問題,請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）本試劑盒僅限于進行存活的細胞或組織的檢測，不可用于固定或凍存的細胞或組織樣品的檢測。

3）檢測緩沖液經過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴重影響染色效果。如果檢測緩沖液發生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續使用。

4）CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關產品